MICROSCOPIA CONFOCAL E WIDEFIELD: QUAL O MELHOR MÉTODO PARA DETECÇÃO DE COLOCALIZAÇÃO ENTRE PROTEÍNAS DE CHROMATOID BODIES DE ESPERMÁTIDES INICIAIS DE MAMÍFEROS POR IMUNOFLUORESCÊNCIA?

Abstract

Na microscopia de luz de fluorescência widefield, a imagem é formada a partir da observação de estruturas pontuais das células, enquanto que, na microscopia de luz confocal, por ser um segmento aperfeiçoado do widefield, é possível a observação com maior detalhamento de estruturas subcelulares podendo-se obter imagens de planos específicos ou cortes ópticos, que podem ser utilizados em reconstruções 3D ou 2D de uma estrutura. O chromatoid body (CB) é uma organela citoplasmática que possui papel no estoque de RNA e proteínas para a diferenciação final dos espermatozoides e que começa a ser visualizada no citoplasma das células germinativas após a meiose I, nos espermatócitos I, apresentando-se na sua forma final no citoplasma de espermátides iniciais, exercendo seu papel até a finalização da espermiogênese. Mutações ou ausência de proteínas alocadas no CB durante a espermatogênese causam infertilidade em ratos. O presente estudo teve como objetivos comparar qual das microscopias de luz citadas acima é o melhor método para detecção por imunofluorescência da co-localização entre uma proteína residente (MVH/MIWI) e uma proteína transiente (BMAL1) de CBs em espermátides iniciais de mamíferos. Na metodologia deste estudo, foram analisadas lâminas com squash preparations de túbulos seminíferos no estágio IV-VI do ciclo espermatogênico provenientes de 4 camundongos Mus musculus adultos e imunomarcadas com os anticorpos α-MVH e α-BMAL1, analisadas pela microscopia widefield. O mesmo tipo de preparação também foi utilizado para obtenção de imagens em microscopia confocal. Os valores de co-localização entre as proteínas analisadas foram calculados pelo Coeficiente de Pearson’s (Rr), sendo que os valores de Rr, k1 e k2 obtidos pela análise em cada uma das microscopias foram comparados pelo teste U (MannWhitney). Como resultados obteve-se que a distribuição dos valores de Rr da co-localização entre as proteínas marcadas e analisadas pela microscopia widefield estavam entre 0,75 e 0,97 (relação linear forte). Para a microscopia confocal os valores estavam entre 0,20 e 0,50 (relação linear fraca). O teste U (Mann-Whitney) demonstrou que todas as comparações entre os valores de Rr, k1 e k2 obtidos pelas duas microscopias apresentaram diferenças estatisticamente significantes (p ≤ 0,05). Como a análise de co-localização foi realizada entre uma proteína residente e uma proteína transiente do CB, sendo proteínas que nem sempre devem se co-localizar nesta estrutura, conclui-se que a microscopia confocal demonstra-se mais eficiente para este tipo de análise, pois demonstrou um coeficiente de sobreposição mais baixo.