ANÁLISES FILOGENÉTICAS BASEADAS NO DNA RIBOSSOMAL E MITOCONDRIAL DE ISOLADOS DE Pythium insidiosum

Abstract

Pythium insidiosum é o agente etiológico da pitiose, uma doença que afeta humanos e animais, principalmente em países de clima tropical e subtropical. Este patógeno não é um fungo verdadeiro, pois pertence ao Reino Stramenopila, Filo Oomycota. Estudos moleculares têm sido realizados recentemente e vêm mostrando que o DNA mitocondrial, particularmente o gene da citocromo c oxidase (Cox II) é um bom marcador para estudos filogenéticos entre as espécies do gênero, bem como para avaliar a variabilidade intraespecífica. Fez-se a análise filogenética de 20 isolados de P. insidiosum provenientes de casos de pitiose equina, humana e canina de diferentes municípios do estado São Paulo. A pesquisa teve como objetivo fazer análises filogenéticas baseadas na região do DNA ribossomal, como a região ITS-1- 5.8S-ITS-2 e a região D1 e D2 da subunidade 28S; e do DNA mitocondrial, gene da citocromo c oxidase II (COX II). Os isolados de Pythium insidiosum foram cultivados em tubos contendo Ágar Sabouraud Dextrose para que seus fragmentos fossem postos em Caldo Sabouraud Dextrose, sendo posteriormente utilizados nos procedimentos de extração de DNA. Com o DNA já extraído, análises da integridade e da concentração desse material genético foram realizadas para se prosseguir com a reação em cadeia da polimerase (PCR) usando primers e perfis de ciclagem específicos para cada região do DNA. A observação dos amplicons em gel de agarose com a posterior purificação desse produto tornou-se possível realizar o sequenciamento e as análises filogenéticas. Dessa forma, com base na nas árvores filogenéticas, a região ITS apresentou baixos bootstraps separando os isolados americanos dos isolados da Tailândia. A região da citocromo c oxidase II permitiu melhor separação geográfica dos isolados americanos dos isolados de P. insidiosum da Tailândia, no entanto observou-se que um isolado ambiental da Tailândia agrupou-se na árvore filogenética desse gene. O entendimento das relações filogenéticas auxilia na compreensão da distribuição geográfica deste patógeno, mas não distingue se há genótipos de P. insidiosum que causam a doença em animais e humanos.